Il requisito più importante per questi prodotti, consumati senza cottura, è un’adeguata qualità microbiologica, che dipende dalle condizioni e dalle modalità di coltivazione, lavaggio, insacco, stoccaggio, trasporto e distribuzione.
L’interesse per le insalate fresche confezionate è in forte aumento in tutta Europa. Si prevede che il mercato europeo crescerà a un tasso di crescita annuo composto di circa il 7,1% dal 2023 al 2029 (KBV - Kassenärztlichen Bundesvereinigung, 2023). Per alimento pronto al consumo si intende un alimento destinato dal produttore/fabbricante al consumo diretto senza la necessità di cottura o altra lavorazione per eliminare o ridurre i microrganismi a livelli accettabili (Regolamento CE n. 2073 della Commissione Europea del 15 novembre 2005). In particolare, le verdure a foglia pronte sono piante orticole commercializzate già lavate in sacchetti sigillati e destinate al consumo crudo. Il requisito più importante per questi prodotti, consumati senza cottura, è un’adeguata qualità microbiologica, che dipende dalle condizioni e dalle modalità di coltivazione, lavaggio, insacco, stoccaggio, trasporto e distribuzione. Alcuni microrganismi possono causare il deterioramento prematuro del prodotto, mentre altri sono pericolosi per l’uomo. Tuttavia, di solito, non si trovano in una percentuale elevata di campioni. Nell’articolo “Dalla fattoria alla tavola: contaminanti fungini e batterici e loro diagnosi nelle fasi di produzione delle insalate pronte al consumo” (From farm to fork: Fungal and bacterial contaminants and their diagnostics in the production steps of ready-to-eat salads), uscito su Trends in Food Science & Technology lo scorso agosto, vengono esaminate le diverse fasi della produzione di insalate in busta, analizzati gli aspetti microbiologici, nonché le metodologie per misurarne la qualità. Da questo articolo si evince che azzerare il rischio microbiologico nelle insalate pronte è statisticamente irrealistico, perché la contaminazione può verificarsi lungo tutta la catena di produzione. Tuttavia, il mercato delle insalate pronte può trarre vantaggio da nuove tecnologie sostenibili che potrebbero supportare le decisioni di gestione del rischio prima che esse raggiungano i consumatori.
I pericoli microbiologici
Le insalate pronte possono ospitare diversi agenti patogeni batterici, tra cui Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus. Esse contengono anche specie di batteri aerobici, lieviti e funghi filamentosi che agiscono come saprofiti o endofiti e possono ridurre la durata di conservazione e aumentarne la tossicità. È risultato che alcuni microrganismi presenti nelle insalate e in altri cibi pronti possiedono geni di resistenza agli antibiotici. Inoltre, le verdure a foglia verde sono state ripetutamente implicate in contaminazioni associate a pericolosi agenti patogeni, come parassiti (Cryptosporidium spp., Cyclospora cayetanensis, Giardia spp., Trichinella spiralis, Toxoplasma gondii) e virus (Astrovirus, Epatite A, Norovirus, Rotavirus, Sapovirus). Le normative alimentari definiscono criteri microbiologici e limiti per la presenza di microrganismi negli alimenti. I ricercatori sostengono che la conoscenza dei fattori che influenzano la qualità degli alimenti pronti sia ancora limitata e, soprattutto, che manchino protocolli di monitoraggio della contaminazione microbiologica condivisi e ripetibili a livello mondiale, tali da consentire il confronto dei risultati man mano che vengono ottenuti. Oltre alla ricerca degli agenti patogeni, nel mercato delle insalate pronte è fondamentale anche la stima della contaminazione da parte di altri microrganismi, come saprofiti fungini, batterici e protozoi, perché i saprofiti possono minare la conservabilità dei prodotti e produrre sostanze tossiche (es. micotossine) pericolose per la salute. Microrganismi che non sono direttamente patogeni per i consumatori, ma che tuttavia portano a un decadimento più rapido del prodotto, e quindi a una minore qualità nutrizionale, possono essere presenti come decompositori epifiti e saprofiti sulle foglie o sulle radici. Si tratta principalmente di funghi filamentosi che possono presentare spore in grado di aderire alle superfici, per cui non si rimuovono facilmente con il lavaggio. Tuttavia, secondo i ricercatori, gli studi che analizzano l’intero microbioma e, in particolare, i fitopatogeni e le specie di microrganismi saprofiti che finiscono nelle buste di insalata pronte sono limitati e sono disponibili poche statistiche su questo tipo di contaminazione.
Sono frequenti anche i casi di diffusione improvvisa di nuove malattie nelle colture utilizzate per le insalate in buste, favorite dal commercio internazionale di sementi.
I rischi di contaminazione lungo la filiera
I ricercatori fanno notare che i cicli di coltivazione degli ortaggi a foglia sono generalmente brevi (20-90 giorni) e senza rotazioni. Ciò aggrava i problemi fitosanitari e l’accumulo di micotossine, poiché le norme sull’intervallo di sicurezza dei pesticidi impediscono una difesa efficace in cicli così brevi. Si prevede che i sistemi idroponici indoor per la produzione di verdure in foglia pronte al consumo miglioreranno la gestione del rischio microbiologico, rispetto ai sistemi convenzionali, poiché operano in un ambiente controllato, evitano il letame animale e le malattie trasmesse dal suolo. Tuttavia, sono emersi anche punti deboli della tecnologia fuori suolo. L’acqua di irrigazione riciclata e le soluzioni nutritive, i semi, le piantine e i substrati sono fonti di contaminazione microbica. La qualità dell’acqua è il fattore più critico, soprattutto nei sistemi a ricircolo, poiché la contaminazione avviene più rapidamente rispetto alla coltivazione convenzionale nel suolo. I principali fattori di rischio nella produzione di verdure a foglia pronte sono la temperatura (trasporto, lavorazione, stoccaggio), l’acqua (qualità, servizi igienico-sanitari), le attrezzature (progettazione, stato igienico) e l’igiene del personale. La temperatura durante le fasi di lavorazione e stoccaggio in genere è di 4-5°C, per garantire la data di scadenza di 7 giorni dopo il confezionamento. Il suo controllo da solo però non è sufficiente. Durante il lavaggio si possono verificare contaminazioni dell’acqua e del prodotto o crociata con agenti patogeni fecali/enterici; pertanto, i disinfettanti sono essenziali per mantenere la qualità dell’acqua. Il cloro è il più utilizzato, con vantaggi come la riduzione al minimo della contaminazione incrociata e svantaggi come la formazione di sottoprodotti di disinfezione pericolosi (DSB), portando alcuni paesi dell’UE a vietarne l’uso. Sono state sviluppate alternative (ad esempio, ozono, acqua elettrolizzata, clorito di sodio acidificato, perossido di idrogeno, acidi organici, bromo e iodio) e il loro uso legale dipende dal paese. Anche le attrezzature, le macchine da taglio e altri strumenti, i nastri trasportatori sono tra i principali critici di contaminazione. Per quanto riguarda l’imballaggio, è necessario determinare la corretta combinazione di pellicole, peso del prodotto e composizione del gas per ciascun tipo di verdura a foglia pronta al consumo, per garantire qualità, sicurezza e durata di conservazione in condizioni igienicamente controllate.
La valutazione della qualità
I cambiamenti nell’aspetto, nella consistenza, nella composizione e nelle caratteristiche olfattive delle insalate pronte sono utilizzati come indicatori della proliferazione microbiologica e dell’integrità igienica generale del prodotto. Il monitoraggio di questi indicatori consente di prevederne la shelf-life. Esistono metodi di valutazione distruttivi e non distruttivi. I primi mirano a stimare quantitativamente la quantità di nutrienti e composti bioattivi e la presenza di processi di senescenza nelle foglie impaccate. I parametri di qualità presi in considerazione comprendono il contenuto di pigmenti fotosintetici (clorofille, carotenoidi, antociani), polifenoli totali e capacità antiossidante, zuccheri totali, vitamina C e perdita di elettroliti fogliari. Queste analisi biochimiche, solitamente effettuate in laboratori specializzati su sottocampioni rappresentativi di lotti di prodotto, forniscono una misura dello stato fisiologico e delle caratteristiche nutrizionali delle verdure in foglia e aiutano a stabilire i requisiti di produzione e conservazione per migliorare la qualità e la shelf-life.
I metodi non distruttivi si basano su tecniche analitiche rapide con una preparazione minima del campione: colorimetria, fluorescenza, spettroscopia di riflettanza, analisi delle immagini e metodi di imaging iperspettrale. La colorimetria viene utilizzata per quantificare i cambiamenti cromatici delle foglie associati alla freschezza o alla senescenza (scolorimento, avvizzimento, imbrunimento). La spettroscopia a fluorescenza determina la qualità delle insalate utilizzando i fluorofori presenti naturalmente. La fluorescenza della clorofilla consente di misurare l’attività fotosintetica e la fisiologia dei campioni, ed è applicabile in particolare alle verdure a foglia verde. Una limitazione significativa di questo metodo è la piccola dimensione dell’area di indagine, con conseguente notevole variabilità, soprattutto lungo le verdure a foglia grande e le insalate a foglia variegata. Un modo efficace per ridurre tale variabilità è quello di ampliare la superficie fogliare utilizzata per la misurazione, cosa che può essere ottenuta con il metodo di imaging della fluorescenza della clorofilla. Gli spettri di riflessione della luce provenienti da tutto lo spettro elettromagnetico, in particolare dalle regioni del vicino infrarosso e dell’infrarosso (710-900 nm), si sono dimostrati efficaci nel monitorare la degradazione, il decadimento della freschezza, la senescenza e il deterioramento microbiologico delle foglie in diverse insalate confezionate. Tutti questi metodi possono essere sostanzialmente migliorati applicando analisi automatizzate delle immagini (colorimetria e fluorescenza) o immagini iperspettrali. Lo sviluppo di adeguati algoritmi di apprendimento automatico può migliorare ulteriormente queste tecniche, consentendo l’analisi del materiale fogliare all’interno della confezione.
La spettroscopia vibrazionale e l’imaging iperspettrale/multispettrale sono da tempo applicate con successo nella rilevazione precoce di attacchi di fitopatogeni su alcune colture, sia in campo che in post-raccolta. Questi studi cercano correlazioni e modelli di regressione tra la risposta spettroscopica e i dati microbiologici quantitativi (ad esempio, biomassa fungina, concentrazione di micotossine o attività enzimatica marcatrice per determinate attività microbiologiche). Alcuni ricercatori hanno combinato tecnologie di spettroscopia e imaging con l’apprendimento automatico per quantificare il deterioramento microbiologico associato alle verdure in foglia pronte al consumo. I sensori a infrarossi (FTIR) o ultravioletti-visibili-vicini a infrarossi (UV-Vis-NIR) non sono invasivi e applicabili in diverse fasi della produzione di insalate pronte. Possono supportare il monitoraggio della qualità del prodotto prima e dopo l’insacchettamento degli alimenti. Tuttavia, sono ancora necessari studi mirati su specifici tipi di verdure e sulla loro calibrazione rispetto alla presenza di specifici microrganismi, nonché sulla loro attività, abbondanza e nocività.
Metodi per rilevare il microbioma
Nell’articolo, i ricercatori si sono soffermati anche sui metodi e protocolli rapidi, economici e affidabili per studiare il microbioma che causa il deterioramento delle insalate confezionate ready to eat.
Alcune tecniche innovative possono valutare il rischio microbiologico quantitativo e qualitativo monitorando in tempo reale i punti critici di produzione per supportare le decisioni di gestione del rischio prima che le insalate raggiungano i consumatori. Gli autori fanno notare che, le tecnologie di sequenziamento del DNA basate su nanopori (Oxford Nanopore Technologies, ONT), abbinate a pipeline di analisi bioinformatiche, in modo che alimentino modelli di previsione appositamente addestrati, e analisi multivariate possono funzionare nella rilevazione precoce della contaminazione microbiologica. Il costo relativamente basso del sequenziamento mediante tecnologia nanopore (ONT), specialmente quando utilizzato in contesti di routine, e l’efficacia delle lunghe sequenze nell’identificazione di patogeni batterici e fungini, possono tracciare l’evoluzione del microbioma del prodotto durante tutto il processo di produzione. La presenza rarefatta di microrganismi patogeni, che spesso rende l’analisi del campione inefficace nella rilevazione precoce del rischio, potrebbe essere gestita efficacemente con appropriati protocolli di amplificazione del genoma estratto totale. Questi sistemi basati sull'amplificazione a spostamento multiplo forniscono elevate rese di DNA amplificato da quantità limitate di materiale campione. Un protocollo di monitoraggio basato sul campionamento adattivo utilizzando kit di sequenziamento Nanopore per l'analisi metagenomica shotgun e un sistema multiplexing consentirebbe di trattare insieme diversi tipi di campioni, anche con concentrazioni variabili di microrganismi patogeni e non patogeni. Inoltre, il database di riferimento potrebbe essere costruito utilizzando solo i genomi di specie batteriche patogene o comunque mirate a specifiche esigenze di monitoraggio senza dover utilizzare database complessi e ingombranti contenenti tutte le specie potenzialmente presenti. Protocolli simili sono stati applicati per la ricerca di specie rare in metagenomi più complessi rispetto a quelli presenti nelle insalate confezionate, come i metagenomi del suolo. Gli studiosi ritengono che una bassa profondità di sequenziamento potrebbe essere sufficiente per sequenziare il DNA genomico del microbioma presente nelle insalate. Il sequenziamento del metagenoma insieme al campionamento adattivo potrebbe rivelarsi una strategia di successo. Questa è solo una prospettiva che dovrà essere verificata attraverso esperimenti. Un protocollo così sviluppato potrebbe essere idoneo a monitorare la concentrazione di microrganismi patogeni in tutte le fasi e i materiali critici, dal suolo e fertilizzanti all’acqua (irrigazione, lavaggio, sanificazione) e alle strutture di stoccaggio, contribuendo alla valutazione quantitativa del rischio microbiologico e dannoso fattori che influenzano la durata di conservazione delle insalate confezionate.
Stefania Milanello Esperta in impianti alimentari e divulgatrice scientifica
